入獄後，陳獨秀一直堅持反日反國民黨的立場，因此對中共1935年“八一宣言”後的政策轉變，開始並不理解，曾作文攻擊“八一宣言”是個“丟醜的文件”，“利用帝國主義之間的沖突”而“親英反日”，“是可恥的選擇主人的態度”。“西安事變”蔣介石被扣消息傳來時，陳獨秀像兒童過年那樣高興。他托人打瞭一點酒，買瞭一點菜，對同獄的人說：我平生滴酒不喝，今天為瞭國仇傢恨，我要痛飲一杯。他先斟滿一杯酒高舉齊眉說：大革命以來，為共產主義而犧牲的烈士，請受奠一杯，你們的深仇大恨有人給報瞭；然後，他把酒奠酹在地上。他又斟瞭第二杯，嗚嗚咽咽哭起來說，為二位已經犧牲的兒子酹酒。情景十分感人。在場的濮德志說：“人們見過他大笑，也見過他大怒，但從未見過他如此傷心地痛哭失聲。”他一邊哭一邊說：“我看蔣介石這個獨夫，此次難逃活命。東方國傢的軍事政變，很少不殺人的。”後來蔣被釋放回南京，他又說：看起來蔣介石的統治是相當穩固的。
1937年“七七事變”後，日本帝國主義為實現其三個月滅亡中國的野心，又向上海進攻，並轟炸南京。陳獨秀的牢房有一次也被震坍屋頂，他躲到桌子底下，幸免於難。後來見到去探望他的陳鐘凡，還談笑自若。於是，陳與胡適、張柏齡等聯名保釋他。當局要他具“悔過書”，他聞之大怒說：“我寧願炸死獄中，實無過可悔”，並拒絕人保，說“附有任何條件，皆非所願”。但是，國民黨在“釋放一切政治犯”的巨大壓力下，被迫在8月23日釋放瞭陳獨秀。為瞭保全他們的面子，國民黨政府在宣告陳獨秀減刑釋放的內部“指令”、“訓令”和公佈的“明令”中，都強調陳獨秀“愛國情殷，深自悔悟”。陳出獄後發表聲明表示：“愛國誠未敢自誇，悔悟則不知所指”；“我本無罪，悔悟失其對象；羅織冤獄，悔悟應屬他人”。
陳獨秀出獄時，面對祖國危亡和國民黨被迫抗戰的嚴重形勢，思想發生重大轉變，主要表現在兩個方面：(一)由打倒國民黨轉變為“擁護國民黨政府領導抗日”。出獄後，他在南京、武漢多次發表講話、文章，宣傳抗戰，提出“民族利益高於黨派利益”；各黨派“一致承認國民黨一黨政權及其對於抗日戰爭之軍事最高統率權”。(二)由反對國共合作轉變為擁護國共合作。出獄後，陳獨秀兩次主動地找到當時在南京籌備八路軍辦事處的葉劍英、博古，表示“贊成抗日民族統一戰線政策”。這無疑是一個180度的大轉變。多年隱居的羅漢也主動出來為陳獨秀與共產黨重新合作抗日而奔走，並在葉劍英等的建議下，親自奔赴延安，因山洪被阻西安。經電報聯絡，中共中央以為陳獨秀要回到黨內，就由毛澤東、張聞天簽署提出三個條件，要求陳：(一)公開放棄並堅決反對托派全部理論與行動，並公開聲明同托派組織脫離，承認過去加入托派之錯誤；(二)公開表示擁護抗日民族統一戰線政策；(三)在實際行動中表示這種擁護的誠意。
張國燾在解釋三個條件時說，托派中願意恢復中共黨籍者，須公開脫離托派並承認已經參加托派的錯誤；不願恢復中共黨籍者，可以與中共在黨外合作，支持中共的抗戰政策。中共中央也不再對抗日的托派人物采取敵視態度。
但是，陳獨秀在聞知三條件後，十分不滿，說：“我不知過從何來，奚有悔！”盡管如此，當時在克服瞭左傾錯誤的中共中央與擁護國共合作的陳獨秀之間，的確出現瞭從未有過的良好氣氛。自然，從當時陳獨秀發表的文章看，在抗日問題上他與黨作一定程度的合作是可能的，但要他擁護黨的全部革命理論和路線，甚至回到黨內，沒有可能。因為他思想深處仍堅持歐洲馬克思主義“城市中心論”的觀念，看不起遊擊隊和農村抗日根據地，不承認中共是無產階級政黨，譏笑毛澤東思想是“山上馬克思主義”。不過這些思想上的深刻分歧還沒有表現出來，而且也不是當時時局要解決的緊迫問題。
然而，正在此時，任中共駐共產國際代表團正副團長的王明和康生，從莫斯科回來，把當時蘇聯正在嚴厲鎮壓托派的狂風帶到中國，又把前一年他們在巴黎《救國時報》上連篇累牘誣陷中國托派和陳獨秀是“漢奸”的醜行，帶回國內，硬是誣陷陳獨秀等是每月向日本特務機關領取津貼的“日本間諜”和“漢奸”，並在中共中央機關報《解放》雜志上公開散佈這種莫須有的罪名。此舉在社會各界引起強烈抗議，嚴重影響黨的威望。陳獨秀和羅漢也以為這是中共中央的意見，分別發表公開信，說瞭一些很激烈的話語。從此陳獨秀與黨的關系就徹底決裂瞭。